全長轉錄組測序
技術簡介
基于Pacbio單分子實時測序技術（Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT），借助其超長讀長優(yōu)勢，無需組裝，直接獲得從5’末端到3’PolyA尾的高質量的全長轉錄本信息。利用全長轉錄組測序，可獲取全長mRNA序列，對基因異構體、可變剪切、融合基因進行準確鑒定。
技術路線
送樣建議
濃度 (Qubit) | 總量 | 完整性及純度 | |
Total RNA | ≥300 ng/μL | ≥10 μg | RIN≥8.0，28S/18S≥1.3；基線平整，5S峰正常；OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.8 |
測序策略 | 數據量 | 周期 | |
三代全長轉錄組測序 | PacBio RS II | 15G data | 95 個自然日 |
案例分析
全長轉錄組測序揭秘玉米轉錄組的復雜性[1]
研究背景
玉米（Zea mays）是全球重要的農作物，也是研究植物轉錄組代謝通路的遺傳模型。玉米基因組序列于2009年公布，后續(xù)利用EST和RNA-Seq轉錄組數據對其基因注釋進行了補充。然而RNA-Seq中，短讀長無法提供轉錄本全長序列，限制了可變剪接形式的鑒定等。
研究方法
采集玉米自交系B73不同發(fā)育階段的6個組織（根、花粉、胚芽、胚乳、幼雌穗、幼雄穗），提取mRNA，構建6種插入片段文庫（<1, 1–2, 2–3, 3–5, 4–6 和>5 kb），進行全長轉錄組測序和二代RNA-Seq測序（每個樣品三個重復）。
圖1. 新鑒定LncRNA分析
研究結果
測序得到的全長轉錄本序列，其中有94.2%能夠比對到玉米RefGen_v3參考基因組上。經聚類分析得到了來自53個家族（RefGen_v3總共57個）的新的isoform，對應26,943個基因，轉錄因子5,423個，其中155個與生長激素應答功能相關。而鑒定的878個候選LncRNA中，867個（平均讀長為1.1kb）為新發(fā)現的LncRNA，具有結構和組織特異性。進一步對isoform、lncRNA和non-lncRNA區(qū)域進行甲基化分析，發(fā)現non-lncRNA genes具有相對較高的CG甲基化水平，而lncRNAs具有相對較高的CHG甲基化水平，這些甲基化水平可能與玉米不同組織中基因的不同表達水平有關。
研究結論
PacBio超長讀長無需組裝即可得到全長轉錄組信息，相比于Illumina短讀長組裝的isoform而言，更能直接準確地獲得isoform信息，有助于解密玉米轉錄組復雜的基因表達信息。
參考文獻
[1]. Wang B, Tseng E, Regulski M, et al. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing[J]. Nature Communications, 2016, 7:11708.
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